Acinetobacter baumannii İzolatlarında Fenilalanin-arjinin-beta-naftilamidin Siprofloksasinin Minimal İnhibitör Konsantrasyon Değerleri ve Dışa Atım Pompası Genlerinin Ekspresyonu Üzerine Etkisi

Abstract

Son yıllarda, dirençli bakteri enfeksiyonlarının tedavisi için en gerçekçi yaklaşımın yeni antimikrobiyal bileşiklerin sentezlenmesinden ziyade, direncin inhibe edilmesine yönelik araştırmalar olduğu düşünülmektedir. Çalışmamızda, Acinetobacter baumannii klinik izolatlarında, i) fenilalanin-arjinin-betanaftilamid (PAβN)’in, siprofloksasin (CIP)’in minimum inhibitör konsantrasyonu (MİK) üzerine etkisinin saptanması, ii) CIP direncini ortadan kaldıran CIP+PAβN konsantrasyonunun hesaplanması, iii) bu konsantrasyonlarda gerçekleşen inhibisyonun PAβN’in çoklu ilaç dışa atım pompası (DAP) sistemi genlerinin ekspresyonu üzerine etkisinden kaynaklandığının gösterilmesi amaçlanmıştır. Trakya Üniversitesi Hastanesinden temin edilerek CIP’e dirençli olduğu tespit edilen A.baumannii izolatları (n= 67)’nda CIP duyarlılığı PAβN varlığında yeniden araştırılmıştır. CIP’in MİK değerinde dört kat ve daha fazla azalma tespit edilen izolatlar dama tahtası testi ve kantitatif gerçek zamanlı revers transkriptaz polimeraz zincir reaksiyonu (qrRT-PCR) ile incelenmiştir. Dama tahtası sonuçlarına göre, CIP direncini ortadan kaldıran PAβN konsantrasyonları ile fraksiyonel inhibisyon konsantrasyonu (FİK) indeksleri hesaplanmıştır. CIP+PAβN kombinasyonunda, inhibisyonun gerçekleştiği konsantrasyonların DAP sistemi genlerinin (adeA, adeB, adeR, adeS, adeF, adeG, adeH, adeL) ekspresyon seviyeleri üzerine etkisi qrRT-PCR ile araştırılmıştır. Dama tahtası testi sonucunda, 11 izolatta PAβN ve CIP arasında sinerjik etki tespit edilirken diğer izolatlarda aditif etki gözlenmiştir. Siprofloksasine dirençli bazı izolatlarda, CIP + PAβN kombinasyonunun izolatın direncini inhibe ettiği ve CIP’e duyarlılığın arttığı gösterilmiştir. 25mg/L ve 100mg/L PAβN varlığında CIP’e dirençli 67 izolatın sırasıyla, 22 (%32.83)’si ve 27 (%40.3)’si CIP’e duyarlı hale gelmiştir. Ayrıca yedi izolatta CIP MİK değerini 1 µg/ml konsantrasyona indiren yani CIP direncini ortadan kaldıran PAβN konsantrasyonu 12.5 µg/ml olarak saptanmış olup, bir izolatta ise CIP MİK değerinin 25 µg/ml PAβN varlığında 0.5 µg/ml’ye, 1.5625 µg/ml PAβN varlığında ise 1 µg/ml’ye düştüğü belirlenmiştir. Tasarlanan PCR yönteminde adeA, adeB, adeC, adeF, adeG, adeH, adeL, adeR ve adeS genlerinin ekspresyon seviyeleri değerlendirildiğinde CIP içeren besiyerlerine PAβN eklenmesi ile çoklu ilaç DAP sistemi genlerinin ekspresyonunun da azaldığı gösterilmiştir (p< 0.05). Çalışmamızda elde edilen sonuçlarla amaca ulaşılmıştır. Bu sonuçlar, direncin inhibe edilmesine yönelik araştırmaların önemini vurgulamaktadır. İnhibitör maddelerle antibiyotiklerin kombine kullanımı alternatif bir tedavi yöntemi olarak düşünülmelidir. Böylece var olan antibiyotiklerin tekrar tedaviye dahil edilebilmesi, zaman ve maliyet açısından da tasarruf sağlanabilmesi olası olacaktır. Bu bulguların, aşırı ifade seviyelerinin gösterildiği izolatlarda regülatör gen bölgelerindeki mutasyonlar da araştırılarak yeni inhibitör adayı bileşiklerin etki mekanizmasının aydınlatılması ve DAP genlerinin ekspresyonu ile ilişkilendirilmesi konusunda yapılacak olan ileri çalışmalarda da kullanılması mümkün olabilecektir.

The most realistic approach in recent years is researching the resistance inhibition rather than synthesizing new compounds. In this study, we aimed to determine i) the effect of phenylalanine-argininebeta-naphthylamide (PA beta N), on minimum inhibition concentrations (MICs) of ciprofloxacin (CIP), ii) to obtain the CIP+PA beta N concentration that inhibits CIP resistance and iii) to show that this inhibition is caused by the effect of PA beta N on the expression of efflux pump ( EF) system genes. Acinetobacter baumannii isolates were collected from Trakya University Hospital. In 67 isolates determined to be resistant to CIP, CIP susceptibility was investigated in presence of PA beta N once again. Isolates determined to have four or more fold decrease in ciprofloxacin MIC values were included in checkerboard assay and quantitative real-time reverse transcriptase polymerase chain reaction (qrRT-PCR). Fractional inhibition concentrations (FICs) were calculated through the PA beta N concentrations that inhibit ciprofloxacin resistance, by the checkerboard assay results. With the combination of CIP+PA beta N, the effect of the concentrations at which inhibition occurs, to the expression levels of EF system genes (adeA, adeB, adeR, adeS, adeF, adeG, adeH, adeL) was investigated by qrRT-PCR. By the checker board assay, a synergistic effect was determined between PA beta N and CIP in 11 isolates, while in other isolates the effect was determined to be additive. In some isolates resistant to CIP, CIP + PA beta N combination inhibited the resistance and increased CIP susceptibility. In the presence of 25 mg/L and 100 mg/L PA beta N, 22 (32.83%) and 27 (40.3%) of 67 isolates became sensitive to CIP, respectively. In seven isolates, 12.5 mu g/ml PA beta N concentration eliminated CIP resistance by decreasing CIP MIC value to 1 mu g/ml. Also, in one isolate the MIC value was 0.5 mu g/ml in the presence of 25 mu g/ml PA beta N and 1 mu g/ml in the presence of 1.5625 mu g/ml PA beta N. After analyzing the expression levels of EF genes (adeA, adeB, adeC, adeF, adeG, adeH, adeL, adeR and adeS) by the qRt-PCR method, it was determined that with the addition of PA beta N to media containing CIP, the expression levels of the genes decreased (p< 0.05). The aim of the study has been achieved with the results obtained. These results highlighted the importance of research on the inhibition of resistance, as well as the synthesis of new antimicrobial compounds. Combined use of inhibitors and antibiotics should be considered as an alternative treatment method. Thus, existing antibiotics can be included in the treatment again, saving time and money. It will be possible to use these findings in further studies to elucidate the mechanism of action of new inhibitor candidate compounds and associate them with the expression of DAP genes, also by investigating mutations in the regulatory gene regions in isolates with over-expression levels.