Farklı stres şartlarında VBNC duruma indüklenen Escherichia coli W3110’da meydana gelen morfolojik ve moleküler değişikliklerin araştırılması

Abstract

Canlı fakat kültürü yapılamayan (VBNC) durum, bakterilerin stres koşulları altında hayatta kalabilmek için geliştirdikleri bir yaşam stratejisi olarak kabul edilmektedir. Bu durumda bakteriler, koloni oluşturamaz ve rutin laboratuvar yöntemleriyle tespit edilemez, ancak patojenitelerini korurlar. VBNC bakteriler sucul çevreler, gıda işleme tesisleri, tarım ürünleri ve hastaneler gibi birçok ortamda bulunarak halk sağlığını tehdit etmektedirler. Bakterilerin bu duruma nasıl geçtiği ve bu durumun nasıl tersine çevrilebileceğini belirlemek için VBNC durumun altında yatan moleküler mekanizmanın anlaşılması son derece önemlidir. Böylece enfeksiyonların önlenmesi ve tedavi edilmesi için yeni ve etkili stratejiler geliştirilebilecektir. Bu sebeple, çalışmamızda VBNC durumunun moleküler mekanizmasının aydınlatılmasına yönelik olarak, hücre bölünmesi ve hücre zarf sistemi ile ilişkisi araştırılmıştır. Bu çalışmada, E. coli W3110 suşu sıcaklık (42 °C), metal (CuSO4) ve antibiyotik (Eritromisin) stresleri altında VBNC duruma indüklendi ve hücrelerin VBNC duruma geçişi plak sayım ve Live/Dead sayım sonuçlarıyla doğrulandı. VBNC duruma indüklenen hücrelerden RNA izolasyonları gerçekleştirildi ve elde edilen RNA’lardan cDNA sentezlenerek bölünme ve hücre zarf stres genleri ile Real Time PCR analizleri yapıldı. Ayrıca tüm stres faktörleri altında VBNC duruma indüklenen hücrelerin hücre iç yapısı ve morfolojisinde meydana gelen değişimleri tespit etmek amacıyla SEM ve TEM analizleri gerçekleştirildi. Bununla birlikte çalışılan stres faktörleri altında VBNC duruma indüklenen hücrelerde lipit peroksidasyonu ve ATR-FTIR spektroskopisi kullanılarak hücre moleküler yapısında meydana gelen değişiklikler analiz edildi. Floresan mikroskop, SEM ve TEM analizleri, VBNC hücrelerin kontrol grubuna kıyasla küçüldüğü, sitoplazmik matrisin azaldığı ve hücre zarları arasında boşluk oluştuğunu gösterdi. Ayrıca, VBNC hücrelerde protein agregatlarının meydana geldiği de tespit edildi. VBNC duruma indüklenen hücrelerle gerçekleştirilen Real Time PCR analizleri sonucunda, bölünme ve hücre zarfı stresinden sorumlu 52 genin ekspresyon seviyesi incelenmiş ve bazı genlerin ekspresyon seviyelerinde stres koşullarına bağlı olarak artış, azalış veya değişiklik olmadığı belirlendi. Daha sonra yapılan analizler neticesinde tüm stres koşulları altında kontrol grubuna göre ekspresyon seviyesi azalan dicB, ymgF ve zapC genleri önemli bulundu. Bu genlerin yanı sıra kontrol olarak dicC geninin de dahil edildiği dört rekombinant suş ile yabani tip ve boş vektör içeren E. coli suşları, aynı stres koşullarında yaşam deneylerine tabi tutuldu. Yaşam deneyleri sonucunda, sıcaklık stresinde DicB, YmgF ve ZapC, metal stresinde YmgF ve ZapC, antibiyotik stresinde ise sadece ZapC aşırı eksprese eden rekombinant suşların VBNC duruma geçişinin azaldığı ve hücrelerin VBNC duruma geçmek yerine öldüğü belirlendi. VBNC hücrelerde gerçekleştirilen lipit peroksidasyonu analizlerinde MDA miktarlarının arttığı tespit edildi. Yapılan ATR-FTIR analizleri sonucunda, VBNC durumun indüksiyonu sırasında RNA, protein ve nükleik asit konsantrasyonlarında biyomoleküler değişiklikler olduğu belirlendi. Özellikle 995 cm⁻¹ RNA bandının VBNC durumun tespitinde güvenilir bir spektrokimyasal biyobelirteç olabileceği tespit edildi. Sonuç olarak, bu tez kapsamında ZapC'nin VBNC durum için önemli bir rol oynadığı belirlendi. Ayrıca, 995 cm⁻¹ RNA bandının VBNC durumunun tespitinde kullanılabilecek önemli bir biyobelirteç olduğu tespit edildi. Bu bulgular, VBNC durumunun moleküler mekanizmasının anlaşılmasına ve tespitine önemli katkılar sağlamakta, aynı zamanda halk sağlığı ve gıda güvenliği açısından büyük önem taşımakta olup, gelecekteki araştırmalar için de bir temel oluşturmaktadır.

The viable but non-culturable (VBNC) state is recognized as a life strategy that bacteria develop to survive under stress conditions. In this state, bacteria are unable to form colonies and cannot be detected by routine laboratory methods, but retain their pathogenicity. VBNC bacteria are found in many environments such as aquatic environments, food processing plants, agricultural products and hospitals, threatening public health. Understanding the molecular mechanisms underlying the VBNC status is crucial to determine how bacteria adopt this strategy and how this can be reversed. Thus, new and effective strategies for the prevention and treatment of infections can be developed. Therefore, in our study, in order to elucidate the molecular mechanism of the VBNC state, its relationship with cell division and the cell envelope system was investigated. In this study, E. coli W3110 strain was induced to VBNC state under temperature (42 °C), metal (CuSO4) and antibiotic (erythromycin) stress and the transition of cells to VBNC state was confirmed by plate counting and live/dead counting results. RNA was isolated from the cells induced to VBNC state, cDNA was synthesised from the obtained RNAs and Real Time PCR analyses were performed with division and cell envelope stress genes. In addition, SEM and TEM analyses were performed to determine the changes in the internal cell structure and morphology of VBNC-induced cells under all stress factors. In addition, lipid peroxidation and changes in cell molecular structure were analysed using ATR-FTIR spectroscopy in cells induced to VBNC state under the stress factors studied. Fluorescence microscopy, SEM and TEM analyses showed that VBNC cells collapsed, the cytoplasmic matrix was reduced and a gap was formed between the cell membranes compared to the control group. It was also found that protein aggregates were formed in VBNC cells. As a result of Real Time PCR analyses performed with VBNC state induced cells, the expression levels of 52 genes responsible for division and cell envelope stress were examined and it was determined that the expression levels of some genes increased, decreased or did not change depending on the stress conditions. As a result of the subsequent analyses, dicB, ymgF and zapC genes whose expression levels decreased compared to the control group under all stress conditions were found to be significant. In addition to these genes, four recombinant strains including the dicC gene as a control and E. coli strains containing wild type and empty vector were subjected to life experiments under the same stress conditions. As a result of the life experiments, it was determined that the recombinant strains overexpressing DicB, YmgF, and ZapC under temperature stress, YmgF and ZapC under metal stress, and only ZapC under antibiotic stress had reduced transition to the VBNC state and the cells died instead of transitioning to the VBNC state. Lipid peroxidation analyses performed in VBNC cells revealed that MDA levels increased. ATR-FTIR analysis showed biomolecular changes in RNA, protein, and nucleic acid concentrations during the induction of the VBNC state. In particular, it was determined that the 995 cm-¹ RNA band could be a reliable spectrochemical biomarker for detecting the VBNC state. In conclusion, it was determined that ZapC plays an important role in the VBNC state within the scope of this thesis. In addition, it was determined that the 995 cm⁻¹ RNA band is an important biomarker that can be used to detect the VBNC state. These findings provide significant contributions to the understanding and detection of the molecular mechanism of the VBNC state, and are also of great importance for public health and food safety, and provide a basis for future research.