Cry1Ac ve bar genlerinin agrobacterium tumefaciens aracılığıyla yem bezelyesine (Pisum arvense L.) aktarılması

Abstract

Bu çalışmada, yem bezelyesinde Agrobacterium tumefaciens aracılığıyla genetik transformasyon protokolünün geliştirilmesi amaçlanmıştır. Bu kapsamda, adventif sürgün rejenerasyonu, gen aktarımının optimizasyonu ve böceklere karşı dirençli transgenik aday bitkilerin PCR ile gen doğrulanmasına yönelik deneysel çalışmalar gerçekleştirilmiştir. Çalışmanın ilk aşamasında, yem bezelyesinin Ateş genotipine ait kotiledon ve kök boğum eksplantlarının adventif sürgün rejenerasyon kapasiteleri, çeşitli oranlarda bitki büyüme düzenleyicileri içeren Murashige ve Skoog (MS) besin ortamlarında değerlendirilmiştir. Çalışmada, 6-Benzil Amino Pürin (BAP) ve Naftalin Asetik Asit (NAA) hormonlarıyla desteklenmiş altı farklı kombinasyon kullanılmıştır. Uygulanan hormon konsantrasyonları sırasıyla şu şekildedir: ( 1.00, 2.00, 3.00, 4.00, 5.00 ve 6.00 ) mg l⁻¹ BAP + 0.2 mg l⁻¹ NAA. Elde edilen rejenerasyon sonuçlarına göre hem kotiledon boğum hem de kök boğum eksplantları için en iyi doğrudan sürgün rejenerasyonu için 3 mg l⁻¹ BAP + 0.2 mg l⁻¹ NAA içeren ortam tespit edilmiştir. Çalışmada rejenerasyonu başarıyla tamamlayan sürgünlerin köklenmesini sağlamak amacıyla, 1.00 mg l⁻¹ İndol Asetik Asit (IAA) içeren besin ortamı kullanılmış ve bu ortamda kök oluşumunun etkili bir şekilde gerçekleştiği belirlenmiştir. Bakteri ile muamele görmüş eksplantların seçiminde kullanılan herbisitlerin dozlarının belirlenmesi amacıyla çalışmada 4 farklı konsantrasyonda 2.00, 4.00, 6.00 ve 8.00 mg l-1 fosfinotrisin içeren MS ortamı kullanılmıştır. Sonuç olarak; 2.00 mg l⁻¹ PPT dozu, seleksiyon ortamında başarılı transformantların seçilmesini mümkün kılmıştır. Genetik transformasyonun optimizasyonu için, 35S-cry1Ac-NosT gen kaseti ile birlikte A. transformasyon vektörlerine klonlanmış seçiçi işaret geni olarak npt-II geni ve Bar geni için LBA-PGG-Bar kaseti kullanılmıştır. Transformasyon çalışmaları sonucunda, toplam 175 adet Cry1Ac ve Bar genlerini taşıyan transgenik aday bitki elde edilmiştir. Aday bitkilerde yapılan PCR sonuçlarına göre Cry1Ac ve Bar genlerinde sırasıyla % 36.66 ve % 17.65 oranlar tespit edilmiştir. Bu çalışma, yem bezelyesi ve benzer bitkilerde zararlı böceklere karşı direnç geliştirme açısından etkili bir genetik transformasyon sistemi kurulabileceğini ortaya koymaktadır.The objective of this study was to develop a genetic transformation protocol for forage pea (Pisum arvense L.) using the bacterium Agrobacterium tumefaciens. The scope of this study included experiments on three main areas: the regeneration of adventitious shoots, the optimisation of gene transfer, and the PCR-based confirmation of transgenic candidate plants that are resistant to insect pests. In the first stage of the study, the adventitious shoot regeneration capacities of cotyledonary node and root node explants of the Ateş genotype of forage pea were assessed on Murashige and Skoog (MS) media, with the explants being supplemented with various concentrations of plant growth regulators. Six different combinations were tested, supported by 6-Benzyl Amino Purine (BAP) and Naphthalene Acetic Acid (NAA) hormones. The following concentrations of hormones were applied: 1.00, 2.00, 3.00, 4.00, 5.00, and 6.00 mg l⁻¹ BAP + 0.2 mg l⁻¹ NAA. Based on the regeneration results, the highest direct shoot regeneration for both cotyledonary node and root node explants was achieved using the medium with 3 mg l⁻¹ BAP + 0.2 mg l⁻¹ NAA. To induce rooting of shoots that successfully completed regeneration, MS medium supplemented with 1.00 mg l⁻¹ Indole-3-Acetic Acid (IAA) was used, and effective root formation was observed in this medium. The appropriate herbicide doses for the selection of explants treated with Agrobacterium were determined by testing MS media containing four different concentrations (2.00, 4.00, 6.00, and 8.00 mg l-1) of phosphinothricin. Consequently, a concentration of 2.00 mg l-1 PPT was determined to be the optimal setting for the effective selection of transformants in the designated selection medium. To optimise genetic transformation, the 35S-cry1Ac-NosT gene cassette was used alongside the NPT-II selectable marker gene, which was cloned into Agrobacterium for transformation. vectors, while the Bar gene was introduced using the LBA-PGG-Bar cassette. A total of 175 transgenic candidate plants carrying the Cry1Ac and Bar genes were obtained at the end of the transformation studies. PCR analysis revealed transformation frequencies of 36.66% and 17.65%, respectively, for the Cry1Ac and Bar genes. This study demonstrates that an effective genetic transformation system can be established in forage peas and similar crops to develop resistance against insect pests.