İnsan kemerin proteinine özgü DNA aptamerinin geliştirilmesi

Abstract

Kemerin, adipositlerden salınan ve glikoz metabolizması, inflamasyon ve enerji dengesi üzerinde düzenleyici rol oynayan bir adipokin proteinidir. Kemerin, biyolojik aktivite açısından birbirinden farklı izoformlara sahiptir; ancak mevcut immünolojik analiz yöntemlerden olan Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA), bu izoformları birbirinden ayırt edememektedir. Özellikle biyolojik aktivitesi yüksek olduğu bildirilen kemerin-S157 izoformu için tanıma elemanlarının bulunmaması, kemerinin fizyolojik süreçlerdeki ve patolojik mekanizmalardaki özgül rollerinin tam olarak aydınlatılmasını zorlaştıran temel bir sınırlılık teşkil etmektedir. Bu tez çalışmasının amacı, literatürde ilk kez, kemerin-S157 izoformu için tek zincirli DNA (ssDNA) aptamerlerinin seçilmesi ve karakterize edilmesidir. Aptamerler, hedef molekülleri yüksek özgüllükle tanıyabilen sentetik nükleik asit dizileridir ve bu özgüllük ancak hedefe karşı seçici bir eleme süreci ile sağlanabilmektedir. Çalışma kapsamında, sistematik zenginleştirme süreci için hedef proteine bağlanabilen dizilerin sistematik olarak zenginleştirilmesine olanak tanıyan Manyetik Boncuk (MB) tabanlı SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment) metodolojisi uygulanmıştır. SELEX sürecinde kemerin-S157 proteini, Ni-NTA kaplı manyetik boncuklar üzerine immobilize edilmiş ve yaklaşık 1015 farklı dizi içeren rastgele bir ssDNA kütüphanesi ile etkileştirilmiştir. Ardışık seçim döngüleri boyunca bağlanma süresi ve hedef protein miktarı kademeli olarak azaltılarak, yalnızca yüksek afiniteli dizilerin seçilmesi amaçlanmıştır. SELEX süreci sonunda elde edilen zenginleşmiş aptamer havuzu Sanger dizileme yöntemi ile analiz edilmiş ve beş farklı aday aptamer dizisi tanımlanmıştır. Elde edilen aday aptamerlerin ikincil yapı kararlılıkları Mfold algoritması ile tahmin edilmiş; bağlanma kinetikleri ve afiniteleri ise floresan izoterm deneyleri aracılığıyla değerlendirilmiştir. Hesaplanan dissosiyasyon sabitlerine göre Apt-C3 (124.1nM), Apt-C4 (224.7 nM) ve Apt-C5 (288.3 nM) en uygun adaylar olarak belirlenmiştir. Bu adaylar arasında Apt-C4 dizisi, daha düşük serbest enerji değişimi (ΔG) ve daha yüksek erime sıcaklığı (Tm) göstermesi nedeniyle yapısal açıdan en kararlı aptamer olarak öne çıkmıştır. Sonuç olarak bu tez çalışması, kemerin-S157 izoformu için ilk ssDNA aptamerlerinin seçimini ve temel karakterizasyonunu gerçekleştirerek, kemerin-S157’nin tanınmasına yönelik ileri çalışmalara bilimsel bir temel sağlamaktadır.Chemerin is an adipokine secreted by adipocytes that plays a pivotal regulatory role in glucose metabolism, inflammation, and energy homeostasis. It exists in multiple isoforms with distinct biological activities; however, conventional immunological assays, such as the Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA), are inherently limited by their inability to distinguish between these variants. The absence of recognition elements specific to the highly active chemerin-S157 isoform represents a significant analytical bottleneck, hindering a comprehensive understanding of chemerin’s specific roles in physiological processes and pathological mechanisms. The objective of this thesis is to bridge this gap by selecting and characterizing the first single-stranded DNA (ssDNA) aptamers specific to the chemerin-S157 isoform. Aptamers are synthetic nucleic acid sequences capable of recognizing target molecules with high specificity—a property achieved through a rigorous and selective enrichment process. To this end, a Magnetic Bead (MB)-based SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment) methodology was employed to facilitate the systematic isolation of sequences with high binding affinity. During the SELEX process, the chemerin-S157 protein was immobilized onto Ni-NTA-coated magnetic beads and incubated with a random ssDNA library containing approximately 1015 unique sequences. Selection pressure was incrementally increased across successive cycles by reducing both the protein concentration and incubation duration to ensure the sequestration of only the highest-affinity binders. Following the enrichment, the resulting aptamer pool was analyzed using Sanger sequencing, which led to the identification of five primary candidate sequences. The secondary structure stabilities of these candidates were predicted via the Mfold algorithm, while their binding kinetics and affinities were quantitatively evaluated through fluorescence isotherm experiments. Based on the calculated dissociation constants, Apt-C3 (Kd: 124.1 nM), Apt-C4 (Kd: 224.7 nM), and Apt-C5 (Kd: 288.3 nM) were determined to be the most viable candidates. Among these, Apt-C4 stood out as the most structurally robust aptamer due to its lower Gibbs free energy change (ΔG) and higher melting temperature (Tm). In conclusion, this study establishes a scientific foundation for the selective detection of chemerin-S157 by providing the first characterized ssDNA aptamers for this isoform. These findings provide a critical framework for the development of future diagnostic platforms and isoform-specific biosensors.