E. coli’nin Fotooksidatif Stres Altındaki Yaşamına pH’ın Etkisi, Bazı Oksidatif Stres Genlerinin Rolünün Belirlenmesi

Abstract

Giriş: Fotooksidatif stres ışığa duyarlı moleküllerin ışığa maruz kaldıkları zaman radikal üretmeleri ile gerçekleşmektedir. Oluşan radikaller hücrelerde her türlü moleküle saldırarak hasar verir. Proteinler, lipitler, karbonhidratlar ve nükleik asitlerin hepsi radikallerden zarar görmektedir. Bu zarardan korunmak için mikroorganizmalar çeşitli korunma stratejileri geliştirmek zorundadırlar. Fotooksidasyon, dezenfeksiyon yöntemi olarak da kullanıldığı için hem halk sağlığı açısından hem de doğada bakterilerin yaşam stratejilerinin anlaşılması açısından fotooksidatif stresin moleküler mekanizmasının aydınlatılması ve fotooksidasyonu etkileyen faktörlerin ortaya konulması için bu çalışma gerçekleştirilmiştir.

Gereçler ve Yöntemler: Bu çalışmada E. coli’nin oksidatif strese karşı korunmasında rol alan genlerden 11 tanesi belirlenmiştir. Japon Ulusal Genetik Merkezinden temin edilen Keio koleksiyon ürünü mutantlar P1 transdüksiyon ile E. coli W3110 bakterisine aktarılmıştır. Bu mutantlar elde edildikten sonra, mutantların farklı pH lardaki (pH 5, 6, 7, 8) fosfat tamponunda fotooksidatif stres altındaki yaşamında rolleri, plak sayım yöntemi ile analiz edilmiştir. Mutasyona uğratılan gen bölgeleri oxyR, soxR, soxS, sodA, sodB, sodC, katG, katE, zwf, ahpC ve btuE genleridir. Önemli rolü olduğu belirlenen genlerin komplementasyon testleri yapılarak rolleri doğrulanmıştır. Bunun için ilgili gen bölgesini içeren ve IPTG indüklenen promotor içeren plazmitler transformasyon ile ilgili mutantlara yerleştirilmiş ve yaşam deneyleri plak sayımı ile yapılmıştır.

Bulgular: Bu çalışmanın sonucunda, fotooksidaitf stresin etkisinin pH ile bağımlı olduğu belirlenmiştir. E. coli W3110 yabani tip bakteri farklı pH değerlerinde fosfat tamponunda 6 saat inkübe edildiği zaman pH 5 ve 6 da başlangıç sayısı olan 6.7 den herhangi bir azalma göstermemişken, pH 7 de 0.81 log, pH 8 de ise 3.15 log azalma olduğu tespit edilmiştir. Belirlenen 11 genden hangisinin bu strese karşı korunmada daha fazla rolü olduğunu belirlemek için mutantlar ile yapılan çalışmalar sonucunda oxyR, soxR, katE, btuE ve sodB’nin yabani tipten çok daha fazla etkilendiği ortaya konulmuş ve komplemantasyon testleri ile de doğrulanmıştır.

Sonuç ve Tartışma: Bu çalışmanın sonucunda pH’ın fotooksidatif stresin etkinliğinde oldukça önemli bir faktör olduğu belirlenmiş, çalışılan 11 genden oxyR, soxR, katE, btuE ve sodB’nin fotooksidatif stres altındaki yaşamda rolleri ortaya konulmuştur.