Pestisit tayini uygulamaları için modifiye manyetik nanopartikül üzerine immobilize edilen kolinesterazların karakterizasyonu ve kinetik parametrelerinin belirlenmesi

Abstract

Enzimler, birçok biyokimyasal ve kimyasal reaksiyonu katalize eden biyolojik katalizörlerdir. Üretim kolaylığı, substrat özgüllüğü ve yeşil kimya özellikleri nedeniyle bu biyokatalizörler çeşitli alanlarda yaygın olarak da kullanılmaktadır. Ancak biyokatalizördeki stabilite ve geri kazanım sorunu endüstriyel uygulamaları kısıtlamaktadır. Bu durumları iyileştirmek ve enzimi daha işlevsel hale getirmek için birçok yönteme başvurulmaktadır. Bu yöntemlerden biri de yüksek verimlilik ve stabilite artışı sağlayan enzim immobilizasyonu yöntemidir. İmmobilize enzimler, serbest enzime göre gelişmiş stabilite, reaksiyon karışımından ayrılma kolaylığı, enzim tüketiminde tasarruf ve genellikle geliştirilmiş aktivite gibi çeşitli faydalar sunduğu bilinmektedir. Enzim immobilizasyonu; enzim moleküllerinin, substratın ya da ürünlerin mevcut durumundan farklı bir katı matris/destek ile hareketsizleştirilmesi olarak tanımlanabilir. Enzim immobilizasyonu için matris veya destek materyali olarak genellikle inert polimerler ve inorganik malzemeler kullanılmaktadır. Bu çalışma kapsamında Fe3O₄ manyetik nanopartikülleri (MNP'ler) sentezlenmiş ve kolinesteraz enzimleri, çapraz bağlayıcı olarak glutaraldehit (GA) kullanılarak fonksiyonelleştirilmiş MNP'ler üzerine immobilize edilmiştir. İmmobilize enzimler (Fe₃O₄@SiO₂-NH₂/GA/AChE/BChE), taramalı elektron mikroskobu-enerji dağılımlı X-ışını spektroskopisi (SEM-EDX) ve FTIR ile karakterize edilmiştir. İmmobilize edilen bu kolinesteraz enzimlerinin kinetik parametreleri, stabilitesi ve pestisit tayinindeki uygulamaların serbest enzime kıyasla üstünlükleri belirlenmiştir. Serbest ve immobilize enzimlerin optimum pH aktivitesi, pH 5–11 aralığında belirlenmiştir. En yüksek aktivite serbest AChE ve BChE için pH 8'de, immobilize AChE ve BChE için ise pH 10'da gözlenmiştir. Kinetik parametreler incelendiğinde, immobilize AChE için Kₘ ve Vₘₐₓ değerleri sırasıyla 0,446 mM ve 0,659 EU mL⁻¹ olarak bulunurken, serbest AChE için bu değerler sırasıyla 0,163 mM ve 0,965 EU mL⁻¹ olarak; İmmobilize BChE için ise Km ve Vmax değerleri sırasıyla 0,438 mM ve 0,527 EU mL⁻¹ olarak hesaplanırken, serbest BChE için bu değerler sırasıyla 0,177 mM ve 0,587 EU mL⁻¹ olarak belirlenmiştir. Pozitif kontrol olarak kullanılan takrin inhibitörünün enzime bağlanma afinitesinin immobilize enzimde serbest enzime kıyasla daha düşük olduğu görülmüştür. Depolama stabilitesi çalışmalarında, 4 °C'de 40 gün boyunca saklanan immobilize AChE'nin başlangıç aktivitesinin %96,2'sini koruduğu, buna karşılık serbest enzimin ise %83,2’sini koruduğu belirlenmiştir. BChE enzimi için ise bu değerler immobilize enzim için %79.2 iken serbest enzim için %55,7’dir. Ayrıca, 20 tekrarlı kullanım testi sonucunda immobilize AChE ve BChE’nin başlangıç aktivitesinin %95'inden fazlasını koruduğu tespit edilmiştir. Pestisit tayini uygulamasında ise nicosulfuronun farklı konsantrasyonda kolinesteraz enzimleri üzerindeki % inhibisyon değerleri ölçülmüştür. Bu % inhibisyon değerlerine bağlı olarak gerçek numunedeki (mısır) nicosülfuron miktarı spektrofotometrik yöntemle belirlenmiştir. İmmobilizasyon işlemi sonucunda enzimin elde ettiği yüksek stabilite ve tekrar kullanılabilirlik, gelecekteki biyoteknolojik uygulamalara yönelik çalışmalara önemli katkılar sağlayabilir.Enzymes are biological catalysts that catalyze a wide range of biochemical and chemical reactions. Owing to their ease of production, substrate specificity, and environmentally friendly characteristics, these biocatalysts are widely used in various fields. However, limitations associated with enzyme stability and recovery restrict their industrial applications. Several approaches have been developed to overcome these limitations and improve enzyme functionality. One such approach is enzyme immobilization, which can provide enhanced stability and improved operational efficiency. Compared with free enzymes, immobilized enzymes offer several advantages, including enhanced stability, ease of separation from reaction mixtures, reduced enzyme consumption, and, in some cases, improved catalytic activity. Enzyme immobilization can be defined as the confinement or attachment of enzyme molecules to a solid matrix or support, thereby restricting their mobility relative to that of the substrate or product. In enzyme immobilization, inert polymers and inorganic materials are commonly used as matrices or support materials. In the present study, Fe₃O₄ magnetic nanoparticles (MNPs) were synthesized, and cholinesterase enzymes were immobilized onto functionalized nanoparticles using glutaraldehyde (GA) as a cross-linking agent. The immobilized enzymes (Fe₃O₄@SiO₂-NH₂/GA/AChE/BChE) were characterized using scanning electron microscopy coupled with energy-dispersive X-ray spectroscopy (SEM–EDX) and Fourier-transform infrared spectroscopy (FT-IR). The kinetic parameters and stability of the immobilized cholinesterase enzymes were investigated, and their advantages over the corresponding free enzymes in pesticide determination were evaluated. The optimum pH values for the activities of both free and immobilized enzymes were investigated over the pH range of 5–11. The highest activities of free AChE and BChE were observed at pH 8, whereas those of immobilized AChE and BChE were observed at pH 10. Regarding the kinetic parameters, the (K_m) and (V_{\max}) values of immobilized AChE were determined to be 0.446 mM and 0.659 EU mL⁻¹, respectively, whereas the corresponding values for free AChE were 0.163 mM and 0.965 EU mL⁻¹. Similarly, the (K_m) and (V_{\max}) values of immobilized BChE were calculated to be 0.438 mM and 0.527 EU mL⁻¹, respectively, compared with 0.177 mM and 0.587 EU mL⁻¹ for free BChE. The binding affinity of tacrine, which was used as a positive control inhibitor, was found to be lower for the immobilized enzymes than for the corresponding free enzymes. Storage stability studies demonstrated that immobilized AChE retained 96.2% of its initial activity after 40 days of storage at 4 °C, whereas free AChE retained 83.2%. For BChE, the residual activities of the immobilized and free enzymes were 79.2% and 55.7%, respectively. Furthermore, reusability tests involving 20 consecutive cycles revealed that both immobilized AChE and BChE retained more than 95% of their initial activities. In the pesticide determination application, the percentage inhibition of cholinesterase activity was measured at different concentrations of nicosulfuron. Based on these inhibition values, the amount of nicosulfuron in a real maize sample was determined spectrophotometrically. The enhanced stability and reusability achieved through enzyme immobilization may make a significant contribution to future research and development in biotechnology applications.