Demir Oksit Manyetik Nanopartikülleri Üzerine Sığır Karbonik Anhidraz Enziminin İmmobilizasyonu ve Karakterizasyonu: CO2 Gideriminde Potansiyel Uygulanabilirliğinin Araştırılması

Abstract

Bu çalışmada, sepharose 4B-L-tirozin sülfanilamid afinite kromotografisi yöntemi ile CA enzimi % 35,98 verim ile saflaştırıldı. CA enzimi için saflaştırma kat sayısı 83,42 ve spesifik aktivite 1122,94 EÜ/mg olarak bulundu. Enzimin saflığını kontrol etmek ve molekül kütlesini belirlemek için %3-8 kesikli sodyum dodesilsülfat-poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) yapıldı ve tek bant gözlendi. Molekül kütlesi ise yaklaşık 29 kDa olarak belirlendi. Sonraki aşamada immobilizasyonu için iki farklı destek materyali sentezlendi. I. destek materyali (Fe3O4-NH2)’nin sentezinde MNP, 3-aminopropil)trietoksisilan (APTES) kullanılarak amin grubu (NH2) ilavesiyle fonksiyonel hale getirildi. Daha sonra glutaraldehit (GA) kullanılarak sığır karbonik anhidraz (BCA), kovalent bağlanma yöntemiyle immobilize edildi. II. destek materyali (Fe3O4@SiO2-NH2)’nin sentezinde ise MNP, tetraetil ortosilikat (TEOS) kullanılarak silisyum oksit ile kaplandı. Ardından APTES ile işlevselleştirilerek aynı yöntem ile immobilize edildi. İmmobilizasyondan önce ve sonra FT-IR, SEM-EDX ve VSM ile karakterizasyonları yapıldı. Aktivite, serbest ve immobilize enzimler için pH 5-9 aralığında belirlenmiş olup optimum pH 9 olarak gözlemlendi. Serbest BCA’nın Km ve Vmax değerleri sırasıyla 4,888 mM ve 3,081 EU mL-1 iken, fonksiyonelleştirilmiş I. destek materyaline immobilize BCA’nın Km ve Vmax değerleri sırasıyla 9,369 mM ve 1,810 EU mL-1 aynı şekilde ikincisi için ise Km ve Vmax değerleri sırasıyla 16,160 mM ve 2,195 EU mL-1 olarak bulunmuştur. İmmobilize enzimlerin operasyonel kararlılığı için 20 defa yeniden kullanıldığında; I. destek materyaline immobilize BCA aktivitesinin % 73’ünü, ikincisi ise aktivitesinin % 86’sını korumuştur. Depolama stabilitesi çalışması için numuneler, 4 ºC’de 60 gün süreyle inkübe edildi. 60 günün sonunda I. destek materyaline immobilize BCA aktivitesinin % 60’ını, ikincisi ise aktivitesinin % 49’unu korurken aynı şartlarda serbest BCA aktivitesinin yalnızca % 17’sini korumuştur. Son aşamada BCA’nın, CO2 giderimindeki potansiyel uygulanabilirliği belirlendi.

In this study, the CA enzyme was purified with 35.98% yield using the sepharose 4B-L-tyrosine sulfanilamide affinity chromatography method. The purification coefficient for CA enzyme was 83.42 and the specific activity was 1122.94 μ/mg. To check the purity of the enzyme and to determine its molecular mass, 3-8% batch sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) was performed and a single band was observed. The molecular mass was determined to be approximately 29 kDa. In the next step, two different support materials were synthesized for immobilisation. In the synthesis of the first support material (Fe3O4-NH2), the magnetic nanoparticle (MNP) was functionalised by the addition of amine group (NH2) using 3-aminopropyl)triethoxysilane (APTES). Then, bovine carbonic anhydrase (BCA) was immobilised by covalent binding method using glutaraldehyde (GA). In the synthesis of the second support material (Fe3O4@SiO2-NH2), MNP was coated with silicon oxide using tetraethyl orthosilicate (TEOS). It was then functionalized with APTES and immobilised by the same method. They were characterised by FT-IR, SEM-EDX and VSM before and after immobilisation. Activity was determined for free and immobilised enzymes in the pH range of 5–9, with an optimum pH of 9 observed. The Km and Vmax values of free BCA were 4.888 mM and 3.081 EU mL -1, while the Km and Vmax values of immobilised BCA on functionalised I. support material were found to be 9.369 mM and 1.810 EU mL-1, respectively, and for the second, the Km and Vmax values were found to be 16.160 mM and 2.195 EU mL-1, respectively. When the immobilised enzymes were reused 20 times for operational stability, the BCA activity immobilised on the first support material retained 73% of its activity, while the second retained 86% of its activity. For the storage stability study, the samples were incubated at 4 °C for 60 days. At the end of 60 days, the first support material retained 60% of the immobilised BCA activity, while the second retained 49% of its activity. Under the same conditions, only 17% of the free BCA activity was retained. In the final stage, the potential applicability of BCA in CO2 removal was determined.